Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Pada Ikan Lele (Clarias sp)


1 Teknik PCR pada Ikan Lele (Clarias sp)
Menurut Erlich (1989), PCR adalah suatu teknik yang sangat tepat dan teknik yang paling sering digunakan untuk biologi molekuler karena mudah, cepat, dan murah. Teknik amplifikasi DNA dari sumber DNA yang terbatas dan kualitas DNA yang rendah dapat dilakukan. DNA yang dihasilkan merupakan DNA yang spesifik dari sejumlah kecil gen-gen yang berbeda. DNA diambil dari sampel ikan Lele yang akan diteliti, penambahan primer RAPD dilakukan sebagai penanda genetik pada PCR. Hasil yang dikeluarkan berupa pita-pita DNA ikan Lele yang sudah diperbanyak dengan urutan sesuai dengan primer yang diberikan. Pita-pita DNA tersebut yang akan dianalisisis untuk diketahui kekerabatanya.

Pada proses amplifikasi DNA oleh PCR diperlukan enzim yang dinamakan dengan “taq polymerase”. Enzim ini diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus yang hidup pada kolam – kolam air panas (Erlich 1989). Menurut Weaver (2004) enzim tersebut adalah enzim yang sangat stabil pada suhu rendah maupun suhu tinggi, sehingga pada proses PCR tidak diperlukan penambahan enzim baru untuk setiap perubahan suhu.

2 Prinsip Kerja PCR pada Ikan Lele (Clarias sp)
Proses PCR terbagi dalam tiga tahapan, yaitu tahap denaturasi DNA (denaturing), tahap penempelan primer pada DPA (annealing) dan tahap pemanjangan (elongation). Tahap-tahap tersebut yang terjadi selama proses amplifikasi DNA berlangsung pada PCR. Tahap pertama pada PCR adalah denaturasi DNA (denaturing), pada tahap pertama DNA diberikan kondisi tinggi berkisar antara 93oC-100oC. tahap denaturasi bertujuan untuk mengubah sifat DNA yang disebabkan suhu tinggi. Perubahan sifat DNA terlihat pada lepasnya rantai ganda DNA menjadi single helix (Dunham 2004).

Tahap kedua adalah annealing atau penempelan primer pada rantai DNA. Primer akan menempel pada masing-masing DNA yang berpisah. Letak menempelnya primer akan spesifik sesuai dengan urutan basa pada primer dan urutan basa pada DNA. Tahap penempelan primer pada DNA bekerja pada kisaran suhu 37oC - 63oC. spesifitas penempelan primer pada rantai DNA bergantung pada suhu yang digunakan. Suhu optimal untuk proses penempelan primer berkisar 3oC - 5oC di bawah melting temperature (Tm) atau suhu lebur dari primer yang digunakan. Semakin tinggi suhu yang digunakan spesifitas akan semakin tinggi, namun amplifikasi akan lebih efisien jika proses penempelan dilakukan pada suhu lebih rendah dari suhu Tm (Dunham 2004).

Tahap ketiga adalah tahap pemanjangan primer (elongation) dengan bantuan enzim taq polymerase dan campuran deoxyribonucleoside triphospate (dNTP). Pemanjangan primer dilakukan pada suhu 72oC (Dunham 2004). Nukleotida bebas digunakan untuk menjadi bahan dasar pemanjangan primer, nukleotida akan dipasangkan pada urutan basa yang sesuai dengan yang dibutuhkan pada pemanjangan primer. Enzim taq polymerase berfungsi sebagai perangkai dan penempel nukleotida pada primer.

Setelah selesai tahap pemanjangan DNA, proses PCR diulang dari tahap awal denaturing – annealing – elongation, tiga tahapan tersebut biasanya disebut dengan 1 siklus. Pada proses PCR umumnya dilakukan lebih dari 1 siklus untuk menghasilkan fragmen DNA spesifik yang banyak.

3. Penanda Genetik pada Ikan Lele (Clarias sp)
Suatu penanda adalah karakter atau sifat yang diturunkan atau diwariskan pada keturunannya dan dapat berasosiasi maupun berkorelasi dengan genotip tertentu dan dapat digunakan untuk mengkarakterisasi atau mendeteksi suatu genotip tertentu (Rafsanjani 2011). Penanda genetik dapat diwariskan secara tegas pada keturunanya dan terpaut dengan sifat yang dikehendaki. Pada perkembangan penanda genetik dapat dikelompokan sebagai penanda sitology, penanda morfologi, dan penanda molekuler.

Penanda molekuler dikelompokan kembali menjadi dua bagian penanda isoenzim dan penanda molekuler (Mulyani 2003 dalam Rafsanjani 2011).
Penanda morfologi merupakan penanda yang mengacu pada karakter morfologi yang terlihat secara jelas pada individu dan diturunkan mengikuti hukum Mendel (Liu 1998). Setiap individu mempunyai gen-gen yang khas yang diekspresikan menjadi morfologi individu tersebut.

Penampakan morfologi dapat dikaitkan dengan gen-gen yang spesifik dan penanda genetik dalam kromosom. Penampakan morfologi mudah diamati dan sejak jaman dahulu dijadikan sebagai penanda genetik untuk melihat kekerabatan. Penanda morfologi mempunyai kelemahan dalam mengidentifikasi keanekaragaman subjektifitas pada penanda morfologi sangat tinggi, tidak efektif, sulit dan rentan dengan kondisi lingkungan (Mulyani 2003 dalam Rafsanjani 2011).

Penanda protein merupakan penanda genetik pada tingkat protein, teknik yang sering digunakan adalah isoenzim. Setiap gen-gen pada DNA menghasilkan protein yang spesifik dengan komposisi asam amino yang spesifik dengan melihat protein yang dihasilkan maka dapat terpetakan gen yang terdapat pada kromosom. Elektroforesis digunakan untuk melihat pita protein berdasarkan muatan dan jenis protein. Kelemahan analisis keragaman menggunakan isoenzim adalah jumlah lokus penanda ini terbatas dan tidak terdapat pada semua jaringan, serta tergantung pada tahap perkembangan organisme yang bersangkutan (Liu 1998).

Perkembangan teknologi biologi molekuler menghasilkan metode penanda genetik yang lebih efisien dan lebih cepat. Penanda genetik molekuler DNA. Secara garis besar tidak berbeda dengan penanda genetik lainya. Keunggulan dari penanda molekuler DNA menurut Liu (1998) dapat dikembangkan dengan cepat dan dalam jumlah yang lebih banyak.

DNA pada setiap sel individu sama dan konsisten, maka pengambilan sampel DNA dapat dilakukan pada setiap bagian tubuh individu. DNA tidak terpengaruh dengan lingkungan dan umur atau tingkat perkembangan individu tidak berpengaruh terhadap DNA. Analisis dapat dilakukan setiap saat tidak bergantung pada waktu. Dibandingkan dengan penanda morfologi teknik penanda molekuler DNA lebih mudah dan murah.

Penanda DNA adalah sebagian kecil daerah yang khas pada DNA yang menunjukan pita polimorfisme yang berbeda ada masing-masing individu dalam satu spesies (Liu 1998). Pita dapat dideteksi melalui dua pendekatan, yaitu hibridisasi asam nukleat contohnya RFLP atau melalui amplifikasi segmen DNA dengan berbasis PCR (mikrosatelit, AFLP, dan RAPD) Erlich (1989).

Posted by Wasiwa
Wasiwa Updated at: January 04, 2015

0 komentar:

Post a Comment